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Publicado el julio 31st, 2020 | por

Myogenes Muster

Wir erhielten Fibroblasten von zwei FSHD-betroffenen Individuen mit somatischem Mosaikismus und erzeugten iPS-Zellen. IPS-Zellklone, die entweder lange oder kurze D4Z4-Arrays enthalten, wurden von demselben Individuum isoliert, erweitert und charakterisiert. Anhand eines kürzlich veröffentlichten Differenzierungsprotokolls [30] identifizierten wir myogene Zellpopulationen, die PAX3, PAX7 oder Titin positiv waren und frühe, mittlere und späte Stadien der Myogenese darstellten. Wir untersuchten PAX3- und PAX7-exprimierende Zellpopulationen auf Nachweis der DUX4-Koexpression durch Immunfärbung isogener menschlicher Zellen mit DUX4, ausgedrückt aus seinem geordneten Kontext und seiner Position am Chromosom 4 Subtelomere. Hinweise auf die normale Funktion von DUX4 können in der Sequenzhomologie des Proteins vorhanden sein, bei der DUX4-DNA-Bindungsdomänen den DNA-Bindungsdomänen von gekoppelten klasse-hototischen Transkriptionsfaktoren am ähnlichsten sind. PAX3 und PAX7 haben sich als wichtige Regulatoren der Myogenese erwiesen [23,24,25], so dass ein Wettbewerb um ähnliche DNA-Bindungsstellen als möglicher Mechanismus der muskelspezifischen Pathogenese der abnormen DUX4-Expression vorgeschlagen wurde [14, 26]. Mutation von PAX3 kann zu craniofacial Anomalien und Hörverlust führen, von denen angenommen wird, dass sie durch dysfunktionale neurale Kammzellmigration verursacht werden [27,28,29], und die dysfunktionale Kammzellfunktion kann auch die visuellen und auditiven Pathologien erklären, die mit FSHD verbunden sind, obwohl dies nicht nachgewiesen wurde. PAX7 wird in Satellitenstammzellen exprimiert, die eine entscheidende Rolle bei der Proliferation und Differenzierung während der Myofiberregeneration und -reparatur spielen [24]. Die Überexpression von PAX3 oder PAX7 in Mausmyoblasten (aber nicht Überexpression anderer patotischer Transkriptionsfaktoren der gepaarten Klasse) hat gezeigt, dass sie die DUX4-Toxizität durch den Wettbewerb um DNA-Bindungsstellen reduziert und als möglicher Mechanismus der FSHD-Pathologie vorgeschlagen [14]. Weitere Unterstützung für dieses Modell kommt von der Beobachtung, dass die Proliferation von Satellitenzellen während der Muskelregeneration bei Mäusen, die DUX4-Transgene enthalten, gehemmt wird [26].

Ein wichtiger Mieter der Wettbewerbshypothese ist die Anforderung, dass DUX4 und PAX3 oder PAX7 in derselben Zelle ausgedrückt werden müssen. Menschliche ES-Zellen und iPS-Zellklone differenzieren sich in skelettalen Myozyten mit progressiver Expression myogener Marker, die für frühe, mittlere und späte Stadien der Myogenese charakteristisch sind. ein Schema des Differenzierungsprotokolls. C = CHIRON99021, L = LDN193189, F = FGF2, H = HGF, I = IGF, N2 = neuronale Ergänzung. b–d Bilder des isogenen Klons hiPSC-mosaic1 mit dem langen D4Z4-Array. e-g Bilder von hiPSC-mosaik 1 mit dem kurzen D4Z4-Array. b, e Helle Feldbilder von Zellen in den verschiedenen Stadien, die in a gezeigt werden. Zellmorphologie geht von kleinen stammähnlichen Zellen (D7) zu spindelförmigen länglichen Zellen, die charakteristischer für Myoblasten (D30) sind, bis hin zu mehrlängestreckten Fasern auf D40. c, f Immunfluoreszenzbilder von PAX3-gefärbten Zellen zu Beginn des Protokolls (D7), die zu differenzierten Myozyten mit d, g Immunreaktivität für PAX7 und Titin gelangen.



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